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  • 荧光探针都拿那些你不知道的化学性质
  • 点击次数:280 发布时间:2018-08-22
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  •   荧光探针是在紫外-可见-近红外区有特征荧光,并且其 荧光性质可随所处环境的性质,如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子。
     
      最常用于荧光免疫法中标记抗原或抗体,亦可用于微环境,如表面活性剂胶束、双分子膜、蛋白质活性位点等处微观特性的探测。通常要求探针的摩尔吸光系数大,荧光量子产率高;荧光发射波长处于长波且有较大的斯托克斯位移;用于免疫分析时,与抗原或抗体的结合不应影响它们的活性。
     
      荧光探针的化学性质:荧光定量PCR所使用的荧光化学制剂可分为两种:荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
     
      实时荧光PCR技术靶基因的确定及引物和探针的设计原则
     
      1.靶基因的确定:选择检测组共有的基因以避免检测的假阴性。
     
      2.检测片段的确定:选择检测组内的保守 、组间特异的序列作为引物探针的设计位置。片段长度70-150bp。
     
      3.引物:长度17-25bp;GC含量30-80%;退火温度(Tm值)58-60℃;避免稳定的引物二聚体及发夹结构;序列不能出现连续的G,3’端避免G或C,最后5个碱基内避免两个以上的G或C。
     
      4.荧光探针:长度20-30bp(Taqman)或16-25bp(MGB);GC含量30-80%;Tm值为68-70℃;避免稳定的二聚体及发夹结构;5’端不能是G;位置尽量靠近上游引物;选择波长差异较大或Fam的荧光标记。
     
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